摘  要：采用Alcalase和Flavourzyme两种蛋白酶对鲍鱼蛋白进行酶解，利用鲍鱼酶解物制备得到的增味剂，经感官评定，具有显著的口感增强作用。

关键词：蛋白酶  鲍鱼 增味

Study on the flavor enhancer prepared by enzymatic abalone

（GuangDong ADD Flavour ＆Fragrance CO.,Ltd.，GuangZhou 510990）

Ren Yanyan

Abstract: Alcalase and Flavourzyme were used to hydrolyze the protein of abalone. The abalone hydrolysate was prepared for flavor enhancer, which proved to have high flavor-enhance effect by sensory evaluation.

Key words: Protease; Abalone ; Flavor enhancer

    鲍鱼是名贵的水产珍品，食用部分主要以腹足为主，其肉质细嫩，鲜而不腻，营养丰富。鲍鱼中可提取的水溶性含氮化合物有：游离氨基酸、肽类、核苷酸、有机碱和相关化合物，此外,不含氮的化合物有：糖、有机酸和无机物，以及其它的化合物如维生素、矿物质和色素等,这些非挥发性成分是鲍鱼鲜美口感的主要来源[1] 。

    在产品开发过程中，我们发现，鲍鱼在特定的酶解条件下，其酶解产物具有强烈的鲜味、浓厚味口感增强作用，不仅体现在本身特征风味的增强，而且对其它呈味体系诸如味精——I+G鲜味溶液以及其它肉类呈味料，均有良好的增味作用。本研究主要从工业化生产角度,考虑到实际生产的可行性和产品的实际应用效果，为咸味香精及复合调味料行业提供一种天然、安全、健康的增味剂。

1 材料与方法

1.1材料与设备

    干鲍鱼（干制皱纹盘鲍，产地：大连）。其它化学试剂为分析纯。

    蛋白酶：碱性蛋白酶Alcalase（2.4AU/g）；风味蛋白酶Flavourzyme（500LAPU/g），生产厂家：NovoNordisk。

    实验设备：干燥箱；电子天平；722可见分光光度计；PHS-2C型酸度计；电热恒温水浴锅；电动搅拌器；离心机；胶体磨；小型喷雾干燥设备。

1.2实验方法

1.2.1 各项成分的测定方法[2] ：

    水分的测定：直接干燥法；灰分的测定：高温灼烧法；总氮的测定：凯氏定氮法；脂肪的测定：索氏提取法；氨基酸态氮的测定：电位滴定法；总糖的测定：蒽酮比色法；

    TCA可溶性氮（TCA-N）的测定[3]：5mL酶解液与5mL 10%TCA（三氯乙酸）混合后静置30分钟，3000r/min离心15分钟得上清液，凯氏定氮法测定上清液中氮含量。

    TCA可溶性肽得率（%）= TCA-N得率 - 氨基酸态氮得率（%）

1.2.2鲍鱼酶解工艺及增味剂的制备

    干鲍鱼 → 清洗 → 绞碎 → 加水（比例为1：8）→ 过胶体磨 →100℃蒸煮20分钟 → 降温至55℃,加入碱性蛋白酶Alcalase（加酶量0.1%）→ 酶解1小时后，加入风味蛋白酶Flavourzyme（加酶量0.1%）→ 继续保温酶解4小时→ 95℃，10分钟灭酶。

    分别取酶解时间为1h、2h、3h及4h的酶解液，加入10%的麦芽糊精，85℃保持20分钟，然后过胶体磨，再经喷雾干燥（进风195℃，出风95℃）得鲍鱼增味剂。

1.2.3 鲍鱼增味剂感官评价方法

    将不同酶解时间制备的增味剂分别按0.1%的添加量，加入到鲜味溶液（谷氨酸钠0.2g、5’-呈味核苷酸二钠0.02g、食用盐0.5g，溶于100g 70℃的水）中。同时做空白对比。

    Friedman排序检验法：7名经验丰富的感官评定员，对5个样品按鲜味、浓厚味或嗜好程度对样品进行排序。使用Friedman排序检验对样品之间是否有显著性差异做出判定[4]。

表1排序法问答表

2结果与讨论

2.1 鲍鱼成分分析

    由表1可以看出，鲍鱼营养丰富，若按干基计算，其粗蛋白含量为57.36%，脂肪含量4.12%,是优质的低脂高蛋白质资源。

表2 鲍鱼主要成分分析

    另据报道，鲍鱼不仅营养价值较高，还富含多种生理活性物质如EPA、DHA、牛磺酸、超氧化物歧化酶等。研究发现从鲍鱼肌肉中提取的水溶性多糖——鲍鱼多糖（abalone polysaccharide,AP）具有明显的抗肿瘤活性，增强机体免疫能力的作用。鲍鱼肌肉蛋白酶解物还能显著提高小鼠机体运动耐力和抗应激能力，同时对学习和记忆有明显增强作用[5]。因此，本研究制备的增味剂又被赋予了一定的保健功能。

2.2 鲍鱼酶解液中酶解产物随时间的变化

    Alcalase（碱性蛋白酶）是由细菌分泌的蛋白质水解酶，主要成分草杆菌蛋白酶A，是一种内切蛋白酶。Flavourzyme（风味蛋白酶）是一种真菌蛋白酶/肽酶的复合体，包含内切酶和外切酶。日本学者好井久雄指出：内切酶几乎没有生成氨基酸的能力，它们只能将蛋白质分解成多肽、水溶性蛋白质及微量的氨基酸，而外切酶（氨肽酶和羧肽酶）才显示出生成氨基酸的能力[6]。

    游离氨基酸是鲍鱼酶解液中的主要呈味成分，它们的含量和比例决定了酶解物的风味特征和增味作用。由图1可以看出，在酶解开始的一小时内，氨基酸态氮并无明显增加，而TCA可溶性氮则增加显著，这是由Alcalase的作用特性决定的。在酶解2～5小时，在Alcalase和Flavourzyme两种酶的共同作用下，氨基酸态氮和TCA可溶性氮的量都有增加，但是氨基酸态氮的增加非常缓慢，这与Flavourzyme中外切酶的活力有直接关系。

图 1 鲍鱼酶解液中酶解产物随时间的变化

2.3 鲍鱼酶解液TCA可溶性肽得率的变化

    酶解过程中产生的肽类物质对酶解产物的呈味也有重要的影响，它们对食品基本味感和特种风味的影响主要是通过与食品的各种呈味成分发生相乘作用，而使食品是总体味感变得协调、细腻，起到增味剂的作用[7]。

图2 鲍鱼酶解液TCA可溶性态肽得率的变化

    有研究显示，用细菌蛋白酶作用得到的酶解产物，分子量小于2500Da的寡肽较多，而来自动物的胰蛋白酶酶解产物中分子量较大的多肽比较多[8]。由于蛋白酶作用位点的位置及数量的不同，会造成酶解片断分子量大小的差异和氨基酸组成的变化。

    由图2 可以看出，随着酶解时间的延长，TCA可溶性氮的得率逐渐提高，在酶解1～3小时有非常显著的增加，但随后增加缓慢。TCA可溶性肽得率则在酶解3小时之前增加，在之后开始减少，这是因为Flavourzyme中外切酶的持续作用，从肽链的末端逐步切下氨基酸，使得酶解液中游离氨基酸增加，而TCA可溶性肽的含量有所减少。

2.4 鲍鱼增味剂增味特性比较

    如表3所示，将不同酶解时间制备的增味剂和空白的鲜味溶液分别编号，由七名有经验的感官评价员对5个样品按鲜味、浓厚味或嗜好程度对样品进行排序。

表3 七名评价员对5个样品的排序结果

    采用Friedman检验对五个样品之间的差异作出判定。

式中：J—评价员数

P—样品数

R1、R2……RP—J个评价员对P个样品评价的秩和

计算得F＝18.26。查表可知，在0.05显著水平上，临界值α（5，7）＝9.49＜F=18.26，所以样品间存在显著差异，再对其差异程度进行检验。样品按秩和由小到大排序为：RD、RE、RC、RB、RA,其数值分别为：10、12.5、23、25.5、33。

计算临界值：

I=2，3，……P，q(I,α)可查表得到

RA－RD＝33-10=23＞γ(5,0.05)=16.13

RB－RD＝25.5-10=15.5＞γ(4,0.05)=15.17

RA－RE＝33-12.5=20.5＞γ(4,0.05)=15.17

RB－RE＝25.5-12.5=13＜γ(3,0.05)=13.84

RA－RC＝33-23=10＜γ(3,0.05)=13.84

RC－RD＝23-10=13＜γ(3,0.05)=13.84

RE－RD＝12.5-10=2.5＜γ(2,0.05)=11.58

将以上结果比较，表示为：D E C B A

    通过以上分析，在5％的显著水平上，D样品鲜味、浓厚味和协调性最佳，E与D无明显差异，其次是C和B样品，二者也无明显差异，最次是空白的味精——I+G溶液，其鲜味和口感比较单一，回味差。因此，考虑到生产成本，选择酶解时间为3小时，制备的增味剂具有显著的口感增强作用。

3结论

    采用Alcalase和Flavourzyme两种酶，对鲍鱼进行分段加酶酶解，所得酶解物含有大量游离氨基酸和TCA可溶性肽，制备得到的鲍鱼增味剂，经感官评定，具有显著的鲜味、浓厚味增强作用。可广泛应用于各种肉类呈味料、海鲜呈味料和复合调味料中。

    由于氨基酸和肽类呈味原理的复杂性，有必要对鲍鱼酶解物中游离氨基酸组分以及肽分子量的分布做进一步的研究，以期找到其内在规律，为咸味香精的研发和生产提供理论支持，这是我们研究的重要方向。

参考文献：

[1]Konosu,S.and Yamaguchi,K.(1982).The flavor components in fish and shellfish.In Chemistry and Biochemistry of Marine Food Products,eds.R.E.Martin,G.J.Flick,C.E.Hebard and D.K.Ward.AVI Publishing Co.,Westport,CT,pp.367-403.

[2]大连轻工业学院，华南理工大学等合编.食品分析.中国轻工业出版社，1994

[3]J H Edwards, W F Shipe. Characterization of plastein reaction products formed by pepsin,α-chymotrypsin, and papain treatment of egg albumin hydrolysates [J]. Journal of Food Science,1978,43:1215～1218.

[4] 张水华，孙君社，薛毅.食品感官鉴评（第二版）.华南理工大学出版社，1999

[5] 张亚琦. 鲍鱼的物性学研究及加工工艺探讨[D]. 中国海洋大学, 2008

[6]陈淘声.酱油及酱类的酿造.化学工业出版社，1993：92

[7]Masashi Ogasawara,Tadayoshi Katsumata,Makoto Egi Taste properties of Maillard-reaction products prepared from 1000 to 5000 Da peptide Food Chemistry 2006,99:600～604.

[8]Gildberg A, Arnesen J A, Carlehog M. Utilisation of cod backbone by biochemical fractionation.Process Biochemistry,2002,38:475～480

作者简介：任艳艳（1979-），女，硕士，主要从事咸味香精基础原料的开发与研究。